腺病毒shRNA干擾載體系統(tǒng)是一種可在多種哺乳動物細(xì)胞中穩(wěn)定干擾靶基因表達(dá)的高效方法。該載體不會整合到宿主細(xì)胞的基因組中，而是以游離DNA形式存在。該系統(tǒng)是體內(nèi)應(yīng)用測試的優(yōu)先使用方法。

腺病毒載體來源于誘發(fā)普通感冒的腺病毒，野生型腺病毒基因組是線性雙鏈DNA。

腺病毒重組載體構(gòu)建完成后轉(zhuǎn)染進(jìn)入包裝細(xì)胞。在包裝過程中，位于兩個(gè)反向重復(fù)序列（ITRs）之間的DNA片段與由包裝細(xì)胞表達(dá)的病毒蛋白進(jìn)一步包裝成病毒顆粒。

當(dāng)病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)宿主細(xì)胞時(shí)，兩個(gè)ITR之間的外源DNA及病毒基因組一起進(jìn)入細(xì)胞，并以游離DNA的形式存在于細(xì)胞核中。由人類U6啟動子驅(qū)動表達(dá)的shRNA將會導(dǎo)致靶基因mRNA的降解。

通過改造優(yōu)化，我們的腺病毒載體缺失了E1A、E1B和E3區(qū)，前兩者與病毒包裝相關(guān)（這兩個(gè)基因已被整合到包裝細(xì)胞的基因組中）。因此，運(yùn)用我們的病毒載體包裝出來的病毒是復(fù)制缺陷型的（只能轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞而不能自我復(fù)制），大大提高了生物安全性。

關(guān)于該載體系統(tǒng)的更多信息，請參考以下文獻(xiàn)。

我們的載體來源于血清5型腺病毒（Ad5）。經(jīng)優(yōu)化，該載體在大腸桿菌體內(nèi)具有很高的拷貝數(shù)，包裝出來的病毒具有高滴度，能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)外源基因的高水平表達(dá)。人類U6啟動子能夠驅(qū)動shRNA的高水平轉(zhuǎn)錄，同時(shí)，我們經(jīng)過優(yōu)化的shRNA莖-環(huán)序列可高效形成有效的干擾RNA。

對宿主基因組造成破壞的低風(fēng)險(xiǎn)性：在轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶細(xì)胞后，腺病毒載體在細(xì)胞核保持著游離DNA的狀態(tài)，可以降低宿主基因組被破壞而致癌的風(fēng)險(xiǎn)，使其成為人類體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的理想載體。

超高病毒滴度：腺病毒可通過再次轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞而得到大量擴(kuò)增，從而獲得超高滴度病毒，慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和AAV載體都不具有這個(gè)特性。我們提供的腺病毒滴度可以達(dá)到>10¹² VP/ml。

宿主范圍廣泛：來源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳動物細(xì)胞都能被腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)，但某些細(xì)胞類型則比較難轉(zhuǎn)導(dǎo)（見下文不足之處）。

體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均有效：我們的載體不僅能用于體內(nèi)活體動物實(shí)驗(yàn)，還具有體外細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)能力。

安全性：為了確保腺病毒載體的生物安全性，我們的腺病毒載體缺失了病毒包裝所必須的基因（這些基因被整合到包裝細(xì)胞的基因組）。 所以，利用我們的腺病毒載體包裝出來的病毒是復(fù)制缺陷型的，并且只有在包裝細(xì)胞中才具有復(fù)制能力。

載體DNA非整合型：腺病毒基因組不會整合到靶細(xì)胞的基因組中，而是以游離DNA的形式存在，并且隨著時(shí)間推移逐漸丟失，特別是在分裂細(xì)胞中。

難以轉(zhuǎn)導(dǎo)特定類型的細(xì)胞：雖然我們的腺病毒載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)很多類型的細(xì)胞包括非分裂細(xì)胞，但對某些特定類型的細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、呼吸上皮分化細(xì)胞、外周血細(xì)胞、神經(jīng)元和造血干細(xì)胞等，卻無法進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

較強(qiáng)的免疫原性：活腺病毒會在動物體內(nèi)引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，從而限制了其在體內(nèi)的某些應(yīng)用。

技術(shù)復(fù)雜：使用腺病毒載體時(shí)，需要在包裝細(xì)胞中產(chǎn)生活病毒，然后測定病毒滴度。這些過程技術(shù)難度更高，周期更長。

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.

U6 Promoter: Drives expression of the shRNA. This is the promoter of the human U6 snRNA gene, an RNA polymerase III promoter which efficiently expresses short RNAs.

Sense, Antisense: These sequences are derived from your target sequences, and are transcribed to form the stem portion of the “hairpin” structure of the shRNA.

Loop: This optimized sequence is transcribed to form the loop portion of the shRNA “hairpin” structure.

Terminator: Terminates transcription of the shRNA.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

ΔAd5: Portion of Ad5 genome between the two ITRs minus the E1A, E1B and E3 regions.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

PacI: PacI restriction site (PacI is a rare cutter that cuts at TTAATTAA). The two PacI restriction sites on the vector can be used to linearize the vector and remove the vector backbone from the viral sequence, which is necessary for efficient packaging.